Значение максимальной плотности тока при электрофорезе (обычно в гелях, таких как агарозный или полиакриламидный гель) зависит от многих факторов, включая используемый буфер, толщину геля, тип разделяемого вещества (ДНК, РНК, белки) и желаемую скорость разделения. Не существует универсальной формулы для расчета максимальной плотности тока, но можно использовать эмпирические правила и формулы, основанные на законе Ома и свойствах используемых материалов.
Общая формула, основанная на законе Ома:
Закон Ома для электрической цепи: I = U / R
Где:
- I — сила тока (в амперах, А) U — напряжение (в вольтах, В) R — электрическое сопротивление (в омах, Ом)
Плотность тока (J) рассчитывается следующим образом:
J = I / A
Где:
- J — плотность тока (в амперах на квадратный сантиметр, А/см²) I — сила тока (в амперах, А) A — площадь поперечного сечения геля (в квадратных сантиметрах, см²)
Факторы, влияющие на максимальную плотность тока:
Буфер:
- Ионная сила: Буфер с более высокой ионной силой (например, ТАЕ — Tris-Acetate-EDTA или ТBE — Tris-Borate-EDTA) будет иметь меньшее сопротивление, поэтому при том же напряжении через гель потечет больший ток. Это может привести к нагреву геля. Концентрация буфера: Более концентрированный буфер также снижает сопротивление. PH: pH буфера влияет на заряд разделяемых молекул и, следовательно, на их подвижность в электрическом поле.
Напряжение:
- Более высокое напряжение (U) приводит к большему току (I) при фиксированном сопротивлении (R) геля. Предельное напряжение: Важно не превышать рекомендуемое напряжение для конкретного геля и оборудования, так как это может привести к перегреву, расплавлению геля, повреждению образцов и даже поломке оборудования.
Сопротивление геля:
- Концентрация геля: Более высокая концентрация геля (например, агарозы или полиакриламида) увеличивает сопротивление. Толщина геля: Более толстый гель имеет большее сопротивление. Температура: При нагревании сопротивление геля обычно уменьшается, что приводит к увеличению тока.
Размер и состав разделяемых молекул:
- Размер: Большие молекулы (например, ДНК большой длины) движутся медленнее, чем маленькие, поэтому для их разделения может потребоваться меньшая плотность тока. Заряд: Заряд молекул (отрицательный для ДНК/РНК) влияет на их подвижность в электрическом поле.
Охлаждение:
- Нагрев: Ток, протекающий через гель, выделяет тепло, что может приводить к денатурации образцов и искажению разделения. Охлаждающие системы: Многие электрофоретические камеры оснащены системами охлаждения (например, охладительные блоки или просто заполнение камеры буфером), позволяющими рассеивать тепло и поддерживать стабильную температуру.
Практические рекомендации и подходы:
- Начните с низкого напряжения: Обычно начинают с низкого напряжения (например, 5-10 В/см для горизонтального электрофореза ДНК) и постепенно увеличивают его, наблюдая за ходом разделения. Контроль температуры: Важно следить за температурой геля. Если гель сильно нагревается, необходимо уменьшить напряжение или добавить охлаждение. Подберите оптимальную плотность тока: Оптимальная плотность тока зависит от конкретного эксперимента и требует подбора. Повышение плотности тока ускоряет разделение, но может привести к ухудшению разрешения и искажению полос. Слишком низкая плотность тока приводит к долгому времени разделения. Используйте справочные данные: Изучите протоколы, опубликованные в литературе, для конкретных типов электрофореза (например, для разделения ДНК определенного размера) и используйте их как ориентир. Правило “1 В на сантиметр” (для горизонтального электрофореза ДНК): Для горизонтального электрофореза ДНК часто используют правило “1 В на сантиметр” между электродами. Например, если расстояние между электродами 10 см, то следует использовать напряжение 10 В. Это лишь приблизительное правило, и его необходимо корректировать в зависимости от конкретных условий эксперимента. Учитывайте инструкции производителя: Всегда следуйте инструкциям производителя оборудования и реагентов. Следите за появлением “улыбок”: “Улыбки” (изогнутые полосы) на геле указывают на неравномерное распределение температуры и, следовательно, на проблему с плотностью тока или охлаждением.
В заключение, хотя прямой формулы для расчета максимальной плотности тока нет, необходимо понимать факторы, влияющие на нее, и использовать знания о законе Ома и свойствах используемых материалов. Рекомендуется начинать с низкого напряжения и постепенно увеличивать его, наблюдая за ходом разделения и контролируя температуру геля. Оптимальная плотность тока достигается путем подбора, исходя из конкретных экспериментальных условий и поставленной задачи.
